一、目的
制訂本規(guī)則，保證實驗室工作人員的健康安全、實驗設備安全衛(wèi)生以及防止對外界環(huán)境造成污染。
二、適用范圍
?? 適用于所有進入微生物實驗室人員。實驗室工作人員必需嚴格遵守安全操作規(guī)程。
三、安全操作規(guī)程：
1.員工安全操作規(guī)程
1.1 實驗室入口處須貼上生物危險標志，注明危險因子、生物安全級別、負責人姓名和電話、進入實驗室的特殊要求及離開實驗室的程序。
1.2 禁止非工作人員進入實驗室。參觀實驗室等特殊情況須經(jīng)實驗室負責人批準后方可進入，做好衛(wèi)生防護，并在有關人員陪同下方可進入，同時注意做好環(huán)境維護及保密工作。
1.3 進行感染性實驗時，禁止他人進入實驗室，或必須經(jīng)實驗室負責人同意后方可進入。免疫耐受或正在使用免疫抑制劑的工作人員必須經(jīng)實驗室負責人同意方可在實驗室工作。
1.4 接觸微生物或含有微生物的物品后，脫掉手套后和離開實驗室前要洗手。
1.5 禁止在工作區(qū)飲食、吸煙、處理隱形眼鏡、化妝及儲存食物。
1.6 盡量以移液器吸取液體，禁止口吸。
1.7 實驗過程中，嚴格按有關操作規(guī)程操作，降低濺出和氣溶膠的產(chǎn)生。
1.8 每天至少消毒一次工作臺面，活性物質濺出后要隨時用75%乙醇或巴氏消毒液消毒。
1.9 實驗人員在配制培養(yǎng)基過程中，需盡量避免接觸性或吸入性危害，特別是配制TTB和碘液等對人體有害的培養(yǎng)基或試劑時，要穿戴工作服、口罩和手套，并在通風櫥中進行。
1.10工作人員應接受必要的免疫接種和檢測(如乙型肝炎疫苗、卡介苗等)。工作人員要接受有關的潛在危險知識的培訓，掌握預防暴露以及暴露后的處理程序。每年要接受一次最新的培訓。人員暴露于感染性物質時，及時向實驗室負責人匯報，并記錄事故經(jīng)過和處理方案。
1.11禁止將無關動物帶入實驗室。
2.無菌室安全操作規(guī)程
2.1無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布專用)，紫外線照射消毒30min以上，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。
2.2無菌室應保持清潔，嚴禁堆放雜物，以防污染。 　　
2.3無菌室應備有工作濃度的消毒液，如5％的甲酚溶液，75％的酒精，0.1％的新潔爾滅溶液，等等。
2.4無菌室應定期用適宜的消毒液滅菌清潔，以保證無菌室的潔凈度符合要求。 　
2.5需要帶入無菌室使用的器械、平皿等一切物品，均應包扎嚴密，并應經(jīng)過適宜的方法滅菌。
2.6工作人員進入無菌室前，必須用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在緩沖間更換專用工作服，鞋，帽子，口罩和手套(或用75% 乙醇等消毒劑再次擦拭雙手)，方可進入無菌室進行操作。
2.7無菌室使用前必須打開無菌室的紫外燈輻照滅菌30分鐘，滅菌后通無菌風至少30min以上人員才能進入。操作完畢，應及時清理無菌室，再用紫外燈輻照滅菌30分鐘。
2.8供試品在檢查前，應保持外包裝完整，不得開啟，以防污染。檢查前，用75％的酒精棉球消毒外表面。
2.9每次操作過程中，均應做陰性對照，以檢查無菌操作的可靠性。
2.10吸取菌液時，必須用移液器吸取，切勿直接用口接觸吸管。
2.11接種針每次使用前后，必須通過火焰灼燒滅菌，待冷卻后，方可接種培養(yǎng)物。
2.12帶有菌液的吸管，試管，培養(yǎng)皿等器皿應浸泡在盛有5%來蘇爾溶液或巴氏消毒液的消毒桶內(nèi)消毒，24小時后取出沖洗。
2.13如有菌液灑在桌上或地上，應立即用5%石碳酸溶液或3％的來蘇爾傾覆在被污染處至少30分鐘，再做處理。工作衣帽等受到菌液污染時，應立即脫去，高壓蒸汽滅菌后洗滌。
2.14凡帶有活菌的物品，必須經(jīng)消毒后，才能在水龍頭下沖洗，嚴禁污染下水道。
2.15無菌室應每月檢查菌落數(shù)。在層流無菌風開啟的狀態(tài)下，取內(nèi)徑90mm的無菌營養(yǎng)瓊脂平板5個，分別放置無菌室四周及中央位置，開蓋暴露30分鐘后，倒置于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，取出檢查。100級潔凈區(qū)平板雜菌數(shù)平均不得超過1個菌落/平皿，10000級潔凈室平均不得超過3個菌落/平皿。如超過限度，應用臭氧發(fā)生器等對無菌室進行徹底消毒，直至重復檢查合乎要求為止。
3.壓力蒸汽滅菌器的安全使用操作程序：
3.1堆放：將需滅菌的物品予以妥善包扎，各包之間留有空隙，依次堆放在滅菌桶的篩板上，以蒸汽穿透，提高滅菌效果。需滅菌物品外需黏上高壓指示膠帶以檢驗滅菌溫度是否達到要求。
3.2 加水：在鍋體內(nèi)注入生活用水，水位一定要超過電熱管2厘米以上（不宜過多）；連續(xù)使用時，每次操作前，必須補足上述水位，以免燒壞電熱管和意外發(fā)生。
3.3 密封：在每次使用高壓鍋前，都必須認真檢查高壓鍋的出氣伐和安全閥，確保其狀態(tài)完好，如有故障，在故障排除之前不得使用高壓滅菌鍋。把堆放好物品的滅菌桶放在鍋體內(nèi)，蓋上鍋蓋并鎖緊。
3.4 加熱滅菌：將滅菌器接通與銘牌一致的電源，按下電源開關，接通電源，指示燈亮，表示電源已正常輸入本器，按下開始按紐電熱管開始加熱工作；非全自動的高壓滅菌鍋要注意排空空氣，確保滅菌時高壓鍋內(nèi)是飽和水蒸氣，高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌期間工作人員需監(jiān)視高壓鍋指示面板上的壓力、溫度和時間等。
3.5 開蓋：滅菌結束后，切勿立即將滅菌鍋內(nèi)的蒸汽排出，否則：由于液體物品的溫度未能下降，而壓力蒸汽突然釋放，會使液體劇烈沸騰，造成溢出或容器爆裂。應待壓力表指針歸零位后，方可開啟鍋蓋。
3.6 滅菌后無菌工器具及培養(yǎng)基應存放于無菌區(qū)域（如滅過菌后的無菌室或生物安全柜內(nèi)），無菌物品需有明確標識。
3.7 每年至少2次用嗜熱脂肪芽孢桿菌作為生物指示劑檢查滅菌效果并記錄，指示物需放在不一達到滅菌的部位（如堆放物品的居中位置）。
4.生物安全柜操作規(guī)程
4.1確認玻璃窗處于關閉位置后，打開紫外燈，對安全柜內(nèi)工作空間進行滅菌。滅菌結束后，關閉紫外燈。安全柜使用前后均需滅菌。
4.2抬起玻璃門至正常工作位置。打開外排風機。打開熒光燈及內(nèi)置風機。檢查回風格柵，使之不要被物品堵塞。在無任何阻礙狀態(tài)下，讓安全柜至少工作10分鐘。
4.3用消毒液徹底清洗手及手臂。穿上工作褂，戴橡膠手套并套在袖口上，如有必要的話，戴防護眼鏡和防護面罩。
4.4按實驗程序放入實驗材料，要將工作區(qū)域內(nèi)的污染物質與潔凈物質分開放置。
盡量將所需要的物品在正式操作前全部放入安全柜，但不要過載，不要擋住前后風口。
4.5盡量避免使用可干擾安全柜內(nèi)氣流流動的裝置和程序。在操作期間，避免隨便移動材料，避免操作者的手臂在前方開口處頻繁移動，盡量減少氣流干擾。
盡量不要使用明火，接種環(huán)之類用紅外滅菌器滅菌。
4.6在操作過程中，如果有物質溢出或液體濺出，在將物品移出安全柜前，要對其表面進行消毒，為防止安全柜內(nèi)有任何殘留的污染物，在安全柜工作過程中，就要將安全柜內(nèi)表面全部消毒。所有接觸了污染材料的物體，在從安全柜中取出前，要進行表面消毒。所有開口容器，從安全柜中拿出前要蓋好。
4.7全部工作結束后，用70%的乙醇或適當?shù)闹行韵緞?，擦拭安全柜?nèi)表面，讓安全柜在無任何阻礙的情況下繼續(xù)至少工作5分鐘，以清除工作區(qū)域內(nèi)浮沉污染。
4.8關閉照明燈和安全柜風機。關閉玻璃門，打開UV燈消毒。滅菌結束后，關閉UV燈。
4.9定期抬起工作區(qū)域下面板，擦拭或沖洗工作面底下空間。

5.標準菌株安全操作規(guī)程
5.1標準菌株由專人保管。保管人負責建立標準菌株目錄；目錄至少應包編號、菌株號、菌種名稱、來源、購買日期、購買數(shù)量、保存方法等。
5.2標準菌株應做好標識后，保存于專用冰箱中。
5.3標準菌株不能隨意轉借其它單位或個人，需要時，須經(jīng)實驗室負責人批準后方可提供。
5.4必須在生物安全柜中進行標準菌株實驗，操作過程中，不要穿戴巳經(jīng)污染的防護性手套觸摸門柄、儀器或污染區(qū)以外區(qū)域，避免擴大污染范圍。
5.5試驗結束后，操作過程中所有可能與生物危險物接觸或被污染的試驗器械和物品，能夠高壓消毒的必須高壓消毒，不能進行高壓消毒的物品，應使用有效的消毒劑消毒處理。
5.6 標準菌株傳代原則上不超過5代。

6.微生物培養(yǎng)物廢棄物安全處理程序
6.1 盡可能使用塑料器材代替玻璃器材,防止利器損傷。非一次性利器必須放入厚壁容器中并運送到特定區(qū)域消毒，最好進行高壓消毒。
6.2 禁止用手處理破碎的玻璃器具。裝有污染針、利器及破碎玻璃的容器在丟棄之前必須應用次氯酸消毒液或其他有效藥品進行消毒。
6.3 所有培養(yǎng)物、廢棄物在運出實驗室之前須經(jīng)巴氏消毒液消毒處理或高壓滅菌后,置于專門污物袋內(nèi)，交由專業(yè)衛(wèi)生處理公司處置。
6.4 實驗設備在運出修理或維護前必須進行消毒。

7、微生物實驗室緊急事故處理辦法
7.1刺傷、切割傷或擦傷。受傷人員應脫下防護服，清洗雙手和受傷部位，使用適當?shù)钠つw消毒劑進行消毒，必要時進行醫(yī)學處理。同時記錄受傷原因和相關的微生物，并保留完整適當?shù)尼t(yī)療記錄。
7.2潛在感染性物質的食入。應脫下受害人的防護服，進行必要的醫(yī)學處理。報告食入材料的鑒定和事故發(fā)生的細節(jié)，并保留完整適當?shù)尼t(yī)療記錄。
7.3潛在危害性氣溶膠的釋放（在生物安全柜以外）。所有人員必須立即撤離相關區(qū)域，暴露人員應接受醫(yī)學咨詢，同時立即通知實驗室負責人和生物安全負責人。為了使氣溶膠排出和使較大的粒子沉降，在一定時間內(nèi)嚴禁人員入內(nèi)，若實驗室沒有中央通風系統(tǒng)，應推遲進入實驗室的時間，同時張貼“禁止進入”的標志。待氣溶膠排出、較大的粒子沉降后，在生物安全負責人的指導下，清理人員穿戴適當?shù)姆雷o服和呼吸保護裝備進行污染的清除。
7.4容器破碎及感染性物質的溢出。應立即用布或紙巾覆蓋被感染性物質污染或受感染性物質溢灑的破碎物品，并倒上消毒劑。作用適當時間后，將覆蓋物以及破碎物品清除，再用消毒劑擦拭污染區(qū)域。玻璃碎片應用鑷子清理，已污染的布、紙巾和抹布等應放在盛放污染性廢棄物的容器內(nèi)。如果用簸箕清理破碎物，應對其進行高壓滅菌或放在有效的消毒液內(nèi)浸泡消毒。所有操作過程中要求戴手套。
若實驗表格或其他打印或手寫材料被污染，應將這些信息復制后，再將原件置于盛放污染性廢棄物的容器內(nèi)，按廢棄物處理的方式進行處理。
7.5未裝可封閉離心桶的離心機內(nèi)盛有潛在感染性物質的離心管發(fā)生破裂。如果機器正在運行時發(fā)生破裂或懷疑發(fā)生破裂，應關閉機器電源，讓機器密閉適當時間（如30min），使氣溶膠沉積。如果機器停止后發(fā)現(xiàn)破裂，不開蓋或立即將蓋子蓋上，并密閉（如30min）。同時應通知生物安全負責人。玻璃碎片應使用鑷子，或用鑷子夾著棉花進行清理。所有破碎的離心管、玻璃碎片、離心桶、十字軸和轉子都應放入無腐蝕性的、已知對相關微生物具有殺滅活性的消毒劑內(nèi)進行消毒。未破損的帶蓋離心管應放在另一個有消毒劑的容器中，消毒后回收。離心機內(nèi)腔應用適當濃度的同種消毒劑多次擦拭，再用水沖洗后干燥。
清理時，應戴結實的手套（如厚橡膠手套），必要時在外面再戴適當?shù)囊淮涡允痔?。所使用的全部材料都應按感染性廢棄物處理。
7.6在可封閉的離心桶（安全杯）內(nèi)離心管發(fā)生破裂。所有的密封離心桶都應在生物安全柜內(nèi)裝卸。若懷疑在安全杯內(nèi)發(fā)生破損，應松開安全杯蓋子并將離心桶高壓滅菌，也可采用化學消毒的方法進行處理。
7.7生物安全柜內(nèi)生物危害溢出。等待至少5min，讓安全柜充滿氣溶膠，清理時應穿戴實驗服，安全眼鏡和手套，且讓安全柜繼續(xù)工作。使用浸泡消毒劑的消毒紙巾吸附溢出物，進行消毒處理應保證一定的接觸時間（至少20min）。并用同樣的消毒紙巾擦拭安全柜內(nèi)壁、工作臺表面和柜內(nèi)所有設備。按照正確的生物廢棄物處理步驟處理被污染的物質，將可回收的被污染物品放入生物危害物回收袋或高壓滅菌盤并且用報紙包起來，然后進行消毒或清理。用消毒劑對無法進行高壓滅菌的物品進行至少20 min的消毒處理后再拿出安全柜。最后脫下個人防護服并放進污染物收集袋中進行高壓滅菌處理。若所要清理的物品達到2級生物安全水平或者更高，應聯(lián)系生物安全辦公室負責人。
7.8使用消毒劑進行清潔的具體步驟如下：用干紙巾覆蓋溢出物(用來吸附液體) 后，再放上浸泡消毒液的紙巾，使消毒劑包圍溢出物，并確保消毒劑與污染溢出物充分接觸，盡可能減少氣溶膠的形成。對溢出物附近的所有物品進行消毒處理，處理一定時間，使消毒劑的消毒作用得到充分發(fā)揮。使用正確的消毒劑擦拭設備，并按照正確的生物危害物處理程序處理被污染的物質。對可回收利用的物品進行消毒處理。